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        90%的人在進行細胞轉染實驗時,幾乎忽略了這6點注意事項!

        發布時間: 2021-11-25  點擊次數: 1177次

        轉染是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。分為

        物理介導方法電穿孔法、顯微注射和基因槍;

        化學介導方法:如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;

        生物介導方法:有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術,是目前最高轉染效率的方法,同時具有細胞毒性很低的優勢。


        但是病毒轉染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法,則各有其特點。需要指出的一點,無論采用哪種轉染技術,要獲得*的轉染結果,可能都需要對轉染條件進行優化。影響轉染效率的因素很多,從細胞類型、細胞培養條件和細胞生長狀態到轉染方法的操作細節。下面列舉一些影響因素。


        90%的人在進行細胞轉染實驗時,幾乎忽略了這6點注意事項!



        1、血清





        A、DNA-陽離子脂質體復合物形成時不能含血清,因為血清會影響復合物的形成。


        B、一般細胞對無血清培養可以耐受幾個小時沒問題,轉染用的培養液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被認為會降低轉染效率,轉染培養基中加入血清需要對條件進行優化。


        C、對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用營養豐富的無血清培養基,或者在轉染培養基中使用血清。對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞,建議使用專用轉染試劑。有條件的話,可以用無血清培養基代替PBS洗細胞兩遍,注意洗的時候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細胞,而是轉動培養板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害,細胞又損失一部分,加了脂質體后,細胞受影響就更大了,死亡細胞會增多。



        2、抗生素(PS)





        抗生素,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉染的培養基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。所以,在轉染培養基中不能使用抗生素,甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣,在轉染前也不必潤洗細胞。對于穩定轉染,不要在選擇性培養基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養基中細胞的健康生長,使用比含血清培養基更少的抗生素量。



        3、細胞狀態





        這點非常重要,不要急于求成,一定要讓細胞處于最佳的生長狀態再做。有文獻說傳代不要超過17代。細胞復蘇后的3代左右時細胞狀態最好,不要用傳了很多代的細胞去做,細胞的形態都會發生變化。大多數已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發現這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。因此,如果觀察到轉染效率降低,可以試著轉染新鮮培養的細胞以恢復最佳結果?;蛘?,幾種來源于經篩選,轉染效率較高細胞亞系的細胞系現在有售。



        4、細胞鋪板密度





        用于轉染的最佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異。因轉染試劑對細胞有毒害作用,細胞太少,容易死。一般轉染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。細胞的融合度必須要達到90%才能做。



        5.啟動子的選擇





        獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比,在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系,如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高,因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。



        6、DNA量





        高質量的DNA對于進行高效的轉染至關重要。轉染的質粒一定純度好、濃度高、無內毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產物表達,48小時mRNA表達最高;72h蛋白表達最高。


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