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        關于細胞轉染實驗,這幾點必須要清楚

        發布時間: 2021-11-25  點擊次數: 1490次

        細胞轉染是指將外源分子如 DNA RNA 等導入真核細胞的技術。可分為瞬時轉染,穩定轉染

            瞬時轉染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數,產生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動子和其他調控元件的分析。一般來說,超螺旋質粒 DNA 轉染效率較高,在轉染后 24-72 h 內分析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

            穩定轉染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體存在。盡管線性 DNA 比超螺旋 DNA 轉入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小,通常需要一些選擇性標記反復篩選得到穩定轉染的同源細胞系。


        主要有下面幾種方法:

        化學法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質體法;物理法:電穿孔法、顯微注射法、biolistic 顆粒傳遞法;病毒介導法:逆轉錄病毒、腺病毒

        A. 陽離子脂質體法:

            帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。過程如下圖:

        圖片

           特點:

            簡單通用,適用性廣,轉染效率高,重復性好,但轉染時需除血清,轉染效率隨細胞類型變化大。由于脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞,所以貼壁比懸浮轉染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。

        B. 電穿孔法:

            利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾,使其形成利于核酸進入的微孔。

        C. 逆轉錄病毒(RNA):

            通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞,之后反轉錄酶啟動合成 DNA 并隨機整合到宿主基因組中。

            特點:穩定轉染,可用于難轉染的細胞、原代細胞,體內細胞等,但攜帶基因不能太大。

        D. 腺病毒(雙鏈 DNA):

            先和細胞表面的受體結合,繼而在αV 整合素介導下被細胞內吞。

            特點:可用于難轉染的細胞。

        圖片


            影響轉染的因素:

            血清 血清影響復合物的形成,降低轉染效率

            陽離子脂質體和 DNA 的最佳量在使用血清時會有所不同,因此想在轉染培養基中加入血清時要進行條件優化。大部分細胞可以在無血清培養基中幾個小時內保持健康,對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用 OPTI-MEM I 培養基。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞,建議使用 LIPOFECTAMINE 2000。

            抗生素

            比如青霉素和鏈霉素,是影響轉染的培養基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。

            細胞代數

            轉染前細胞最好經過 1-2 次傳代保證細胞生長旺盛容易轉染,注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉染。

            細胞鋪板密度

            一般轉染時,貼壁細胞密度為 70%-90%,懸浮細胞密度為 2*10^6--4*10^6 細胞/ml 時效果較好。確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。

            DNA 質量

            DNA 質量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術基于電荷吸引原理,如果 DNA 不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成和轉染的進行。

        感謝您的關注,祝您科研順利!


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