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        細胞轉染的方法

        發布時間: 2021-11-25  點擊次數: 2052次

        細胞的轉染方法



        細胞轉染是指將外源分子如DNA,RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展,轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中,其應用越來越廣泛。




        細胞轉染的種類主要是瞬時轉染和穩定轉染,目的和區別如下所示:

        隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。如下圖所示:


        圖片


        下面分別介紹下原理和應用特點:



        化學轉染法


        1. DEAE-葡聚糖法


        原理:帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞。

        主要應用:瞬時轉染

        特點:相對簡便、重復比磷酸鈣好,但對細胞有一定的毒副作用,轉染時需除去血清。聚合物濃度、核酸或蛋白質與聚合物的比值,以及轉染的持續時間是重要的優化參數,另外,此方法對附著細胞的轉染非常有效,也可用于某些懸浮細胞系。(詳細信息可參考文獻:Gulick T .Transfection using DEAE-dextran. Curr Protoc Cell Biol. 2003 Aug;Chapter 20:Unit 20.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2004s19.)。



        2. 磷酸鈣共沉淀法


        原理:DNA與濃縮的氯化鈣溶液混合,然后添加到含有磷酸鹽離子的緩沖液中,形成磷酸鈣-DNA沉淀物,磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞。

        主要應用:穩定轉染,染瞬轉染

        特點:不適用于原代細胞(所需的DNA濃度較高),操作簡便但重復性差,有些細胞不適用細胞建議用CSCL梯度離心,轉染時拷貝數較多。



        3. 陽離子脂質體法


        原理:帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物,然后脂質體上剩余的電核與細胞膜上的唾液酸殘基的負電核結合;另一種解釋是通過細胞是內吞作用而被進入細胞。(若DNA濃度過高,中和脂質體表面電核,而降低了與細胞的結合能力)。

        主要應用:穩定轉染,瞬時轉染,所有細胞

        特點:使用方法簡單,可攜帶大片段DNA,通用于各種類型的裸露DNA或RNA,能轉染各種類型的細胞,沒有免疫原性。雖在體外基因轉染中有很高的效率,但在體內,能被血清清除,并在肺組織內累積,誘發強烈的抗炎反應,導致高水平的毒性,這在很大程度上限制了其應用。(生工產品編號E607403 LipoHigh 脂質體高效轉染試劑)。結果如下圖所示:


        圖片

        pEGFP-N1 質粒轉染 Hela 細胞。轉染前一天將 Hela 細胞接種于 24 孔板中,1E+5 個細胞/孔;轉染前將細胞培養基換成無血清培養基,按 LipoHigh (µl):DNA (µg)= 3:1 進行轉染;轉染 4 小時后更換培養基為含有血清的新鮮培養基, 24 小時后,奧林巴斯 IX73 熒光倒置顯微鏡下觀察結果。



        4. 陽離子聚合物


        原理:帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用,并通過內吞作用進入細胞。

        應用范圍:穩定轉染,瞬時轉染,所有細胞

        特點:除了具有陽離子脂質體的轉染效率高,操作簡單,適用范圍廣,重復性好等特點外,還具有在體內,轉染效率高,細胞毒性低等特點,是新一代的轉染試劑。(生工產品是E607401 PolyHigh 非脂質體高效轉染試劑)。結果如下圖所示:

        圖片

        pEGFP-N1 質粒轉染 HepG2 細胞。轉染前一天將 HepG2 細胞接種于 24 孔板中,1E+5 個細胞/孔;轉染更換新鮮培養基,按 PloyHigh (µL):DNA (µg)= 2:1 進行轉染;轉染 4 小時后更換培養基,24 小時后,奧林巴斯 IX73 熒光倒置顯微鏡下觀察。




        病毒轉染法


        1.逆轉錄病毒


        原理:通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞,之后反轉入酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中。

        主要應用:穩定轉染,特定宿主細胞

        特點:可用于難轉染的細胞、原代細胞,體內細胞等,但攜帶基因不能太大(<8kb),要求細胞要處于分裂期,需考慮安全因素。如下圖所示:

        圖片

        逆轉錄病毒表達系統:逆轉錄病毒將自身基因組及其攜帶的外源基因隨機、穩定地整合入宿主細胞基因組中,可實現目的基因穩定、長期的表達逆轉錄病毒表達系統根據不同的包裝細胞系可分為單嗜性、雙嗜性和泛嗜性,不同包裝細胞產生的逆轉錄病毒能夠特異性地感染某一個或某一類宿主細胞。該病毒包裝細胞系為plat E細胞系,該細胞系包含gag、pol和env基因,因此轉染單一表達質粒就可以包裝出逆轉錄病毒,但是該病毒具有很強的針對性。(圖片來源于網絡)



        2.腺病毒


        原理:先和細胞表面的受體結合,繼而在αv整合素介導下被細胞內吞

        主要應用:瞬時轉染,特定宿主細胞

        特點:可用于難轉染的細胞,需考慮安全因素。如下圖所示:

        圖片

        腺病毒表達系統:一種很常用的哺乳動物病毒表達系統;但與慢病毒不同的是,腺病毒基因組及其攜帶的外源基因不會整合入宿主細胞的基因組中,而是游離于宿主基因組外獨立表達,因此可實現目的基因瞬時、高豐度的表達,同時還避免了因整合而引發的潛在的基因突變和隨機效應,安全性和可控性高。(圖片來源于網絡)




        物理轉染法


        1.基因槍粒子轟擊法


        原理:將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞,DNA在胞內逐步釋放,表達。

        主要應用:瞬時性轉染,穩定轉染

        特點:可用于人的表皮細胞,纖維原細胞,淋巴細胞系以及原代細胞。對應的結果如下圖所示:

        圖片

        HEK 293細胞術后即刻激光共聚焦掃描顯微照片

        用Cy3標記的siRNA包裹的直徑為1.0μm的金粒子在100psi的氦氣壓力下進行轟擊。Cy3標記siRNA上樣:2μg/mg金粒子,a)透射光圖像,b)共焦熒光圖像,c)合并圖像。白色箭頭顯示金顆粒。紅色區域代表Cy3標記siRNA的分布。(圖片來源于Masaki Uchida,Transfection by particle bombardment: Delivery of plasmid DNA into mammalian cells using gene gun .Biochimica et Biophysica Acta 1790 (2009) 754–764)。



        2. 顯微注射法


        原理:用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核。

        主要應用:穩定轉染,瞬時轉染

        特點:轉染細胞數有限,多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞。下面是報道的一篇注射法轉染的結構圖:

        圖片

        eGFP和mCherry質粒注射

        (a) 以1:1的比例注射eGFP和mCherry質?;旌衔锏腍FF細胞。(b) 用eGFP和mCherry質粒的混合物以9:1的比例注射HFF細胞。(來源于文獻:Chow YT,Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes.Sci Rep. 2016 Apr 12;6:24127. doi: 10.1038/srep24127.)



        3. 電穿孔法


        原理:將細胞短暫暴露于電場中,高脈沖電壓破壞細胞膜電位暫時穿孔,DNA通過膜上形成的小孔可以吸收外來的遺傳物質,此方法也適用于傳遞蛋白質。

        主要應用:穩定轉染,瞬時轉染,所有細胞

        特點:適用性廣,除了質粒外,還可轉染大的基因組(>65kb)但細胞致死率高,DNA和細胞用量大, 需根據不同細胞類型優化電穿孔實驗條件,拷貝數較少(1-20)。(詳細的信息可以參考文獻Potter, H., & Heller, R. (2018). Transfection by  electroporation.Current Protocols in Molecular Biology, 121, 9.3.1–9.3.13. doi:10.1002/cpmb.48)。




        理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術,是目前最高轉染效率的方法,同時具有細胞毒性很低的優勢。但是,病毒轉染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法,則各有其特點。需要指出的一點,無論采用哪種轉染技術,要獲得*的轉染結果,可能都需要對轉染條件進行優化。影響轉染效率的因素很多,從細胞類型、細胞培養條件和細胞生長狀態,到轉染方法的操作細節,都需要考慮。目前實驗室可行的最主要的細胞轉染方法是脂質體轉染法。







        脂質體轉染法操作步驟


        1. 準備細胞(24 孔板為例): 

        a) 貼壁細胞:轉染前18~24小時,用500 µl 不含抗生素的培養基接種0.5~2E+5 個細胞于24孔板中,并將細胞培養板置于37°C,5% CO2培養箱培養,轉染前細胞密度達到70~90%為理想狀態(具體密度視細胞的不同可進行適當調整)。 

        b) 懸浮細胞:在準備轉染前,用500 µl不含抗生素的培養基接種4~8E+5個細胞即可。 

        2. 準備轉染工作液: 

        a) 將 0.8~1 µg質粒DNA溶于50 µl細胞培養基中,輕輕混勻,室溫靜置5 min; 

        b) 將 2~3 µl 的轉染試劑溶于50 µl細胞培養基中,輕輕混勻,室溫靜置 5 min; 

        c) 將上步含有轉染試劑的培養基加入含有質粒DNA的培養基中,輕輕混勻,室溫靜置 20 min; 

        3. 將上述轉染混合液,逐滴滴入接種好的細胞中,輕輕混勻后置于37°C,5% CO2培養箱中進行培養; 

        4. 4~8 小時后,更換新鮮培養基繼續培養; 

        5. 轉染24~48小時后,觀察或收取細胞。如果篩選穩定細胞株,則在轉染24小時后將細胞按1:10或更高的比例接種到新鮮培養基中,第二天加入選擇培養基篩選。




        參考文獻

        1. Gulick T .Transfection using DEAE-dextran. Curr Protoc Cell Biol. 2003 Aug;Chapter 20:Unit 20.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2004s19.

        2. Masaki Uchida,Transfection by particle bombardment: Delivery of plasmid DNA into mammalian cells using gene gun .Biochimica et Biophysica Acta 1790 (2009) 754–764

        3. Chow YT,Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes.Sci Rep. 2016 Apr 12;6:24127. doi: 10.1038/srep24127.

        4. Potter, H., & Heller, R. (2018). Transfection by  electroporation.Current Protocols in Molecular Biology, 121, 9.3.1–9.3.13. doi:10.1002/cpmb.48



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