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        細胞轉染技術原理及應用(瞬時轉染和穩定轉染)

        發布時間: 2022-03-14  點擊次數: 1275次

        常規轉染技術可分為兩大類,一類是瞬時轉染,一類是穩定轉染(永(jiu)轉染)。前者外源DNA/RNA 不整合到宿主 染色體中,因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數,產生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動子和其它 調控元件的分析。

        一般來說,超螺旋質粒DNA 轉染效率較高,在轉染后24-72 小時內(依賴于各種不同的構建)分 析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩定轉染,外源DNA 既可以整 合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。

        盡管線性DNA 比超螺旋DNA 轉入量低但整合率高。 外源DNA 整合到染色體中概率很小,大約1/104 轉染細胞能整合,通常需要通過一些選擇性標記,如來氨丙基轉移 酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B 磷酸轉移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復篩選,得到穩定轉染的同源細 胞系。

        轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大,許多轉染方法需要優化DNA 與轉染 試劑 比例,細胞數量,培養及檢測 時間等。一些傳統的轉染技術,如DEAE 右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質體法各有利弊,其主要原理及應 用特點見下表:

        (各種轉染方法的比較) 除上述傳統方法外,近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術,以其適用宿主范圍廣,操作簡便對 細胞毒性小,轉染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine, PEI)的轉染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結構不易于進一步改性,且其合成工藝復雜。

        聚乙烯亞胺是一種具有較 高的陽離子電荷密度的有機大分子,每相隔二個碳個原子,即每“第三個原子都是質子化的氨基氮原子,使得聚合 物網絡在任何pH 下都能充當有效的“質子海綿"(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種 屬細胞,其效果好于脂質聚酰胺,經進一步的改性后,其轉染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細胞毒性低。大量 實驗證明,PEI 是非常有希望的基因治療載體。

        目前在設計更復雜的基因載體時,PEI 經常做為核心組成成分。線 型PEI(Line PEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,過 去的研究認為在不考慮具體條件,LPEI/DNA 轉染復合物的細胞毒性較低,有利于細胞定位,因此與BPEI 相比應該 轉染效率高一些。

        但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的轉染復合物,從而提高轉染效率,但同時細胞 毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI 衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實驗中發現這種PEI 的毒性低, 但轉染效率卻較高。



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